Naslov (srp)

Varijante u genima-modifikatorima beta-talasemijskih sindroma kao regulatori genske ekspresije i populaciono-genetički markeri

Autor

Radmilović, Milena

Doprinosi

Pavlović, Sonja
Pavićević Savić, Dušanka
Stoiljković Petrović, Maja
Nikćević, Gordana

Opis (eng)

p-thalassemia syndromes belong to a group of inherited hemoglobin disorders characterized by a defect in [3-globin chain synthesis. Clinical manifestations of p-thalassemia are extremely diverse, spanning from symptomatic hypochromia and microcytosis to transfusion-dependent form of anemia. This phenotypic variability in most cases cannot only be attributed to allele variations within p-globin gene itself. Any factor that reduces the imbalance between a- and p- globin polypeptide chains is considered to be an important modifier of this disorder. Specifically, production of fetal hemoglobin (HbF) trough adulthood could ameliorate the severity of p-thalassemia phenotype since y-globin polypeptide chains compensate the lack of the functional p-globin polypeptide chains. This is the reason why y-globin genes are considered to be secondary modifiers of P-thalassemias.In recent studies, KLF1 gene emerged as a potential modifier gene of p-thalassemias. This gene encodes KLF1, erythroid-specific transcriptional factor involved in the process of erythroid differentiation. Number of known KLF1 genetic variants, as well as our knowledge of different phenotypes associated with these variants is very limited.In this paper, the frequency of the most common p-thalassemia mutations, as well as chromosomal background against which these mutations arose, was studied. PCR and sequencing-based methods were used.This study includes the analysis of the -158 (C>T) 6y-globin gene variant and a 4 bp deletion at - 225 to -222 of the Ay-globin gene promoter, and their affect on the expression of fetal globin genes. Interactons between these potential regulatory elements and transcription factors were also analyzed. These in vitro analisis were conducted under normal conditions and under erithroid stress caused by addition of erithropoetin.In order to identify potential secondary modifiers of p-thalassemia, KLF1 gene was sequenced and detected genetic variants were analyzed as variants likely to be associated with high levels of HbF. The effect of detected variants on KLF1 and BCL11A gene expression was also studied using the RQ.-PCR ("Real Time") method.The results of our study showed that Hb Lepore-BW was the most common cause of thalassemia in Serbia, with frequency of 26.2%, while IVS-ll-745, p°39 i IVS-l-110 genetic variants account for more than 50% of all affected p-globin alleles. Haplotype analysis depict haplotype I and II as the most frequent haplotypes in Serbia. This study also revealed the association between haplotype I and Hb Lepore-BW, IVS-l-1 and IVS-l-110 variants, as well as between haplotype II and p°39 variant.Results of our functional analysis indicate that the -158 (C>T) sy-globin gene variant has no effect on Gy-globin gene expression, neither in normal conditions, nor under erythroid stress. On the other hand, functional analysis of the 4 bp deletion affecting Ay-globin gene promoter, indicated the presence of the potential regulatory element acting only under erythroid stress.In our study of individulas with elevated HbF levels, two novel KLF1 variants were identified: promotor variant -148 (G>A) and variant affecting second exon of KLF1 gene, p.F182L. Also,p.S102P variant was detected. The study of the effect of these genetic variants on BCL11A and KLF1 gene expression pointed out the promoter region containing -148 (G>A) variant, as a potential regulatory element of KLF1 gene expression.The results presented in this study can lead to a better understanding of phenotypic diversity and mechanisms playing a central role in the pathophysiology of p-thalassemia syndromes. The study of variants within modifier genes of [3-thalassemia and their influence on phenotypic variability will provide important information for devising gene therapy treatments for these monogenic disorders.

Opis (srp)

P-talasemijski sindromi pripadaju grupi naslednih oboljenja hemoglobina koju odlikuje poremećena sinteza p-globinskog lanca. Kliničke manifestacije p-talasemija variraju od simptomatske hiporhromije i mikrocitoze do teškog oblika anemije koju odlikuje zavisnost pacijenata od čestih transfuzija. Ova fenotipska varijabilnost najčešće se ne može objasniti samo genotipom |3-globina, odnosno različitim alelskim varijantama unutar samog p-globinskog gena (primarni modifikatori p-talasemijskih sindroma). Nairne, smatra se da bilo koji faktor koji umanjuje disbalans izmedu a- i [3-globinskih lanaca, predstavlja potencijalo važan modifikator ovih oboljenja. Tako, sinteza fetalnog hemoglobina (HbF) i u adultnom dobu, djelimično ublažava kliničku sliku jer se nedostatak funkcionalnog p-globinskog lanca kompenzuje viškom fetalnih, y-globinskih lanaca, zbog čega se y-globinski geni svrstavaju u sekundarne gene- modifikatore p-talasemijskih sindroma.Kao potencijalni gen-modifikator p-talasemijskih sindroma, u novijim studijama, navodi se i KLF1 gen koji kodira eritroidno-specifični transkripcioni faktor uključen u proces eritroidne diferencijacije. Broj do sada detektovanih genetičkih varijanti u KLF1 genu, kao i naše znanje o različitim fenotipovima koji se dovode u vezu sa ovim varijantama veoma je ograničeno.U ovom radu ispitivana je učestalost najčešćih alelskih varijanti p-globinskog gena, uzročnika (3- talasemija u Srbiji. Takođe, radena je i haplotipska analiza p-globinskog lokusa, kako bi se ispitao uticaj hromozomskog okruženja na fenotip. Korišćena je metodologija bazirana na PCR i sekvenciranju.Ova teza obuhvata ispitivanje uticaja -158 (C>T) varijante u promotoru Gy-globinskog gena kao i delecije (-AGCA) na poziciji -225 do -222 u promotoru Ay-globinskog gena, na ekspresiju izbačena riječ fetalnih gena čovjeka, i to funkcionalnim esejima u ćelijskoj kulturi. Analizirane su i interakcije ovih potencijalnih regulatornih elemenata sa transkripcionim faktorima esejima usporene elektroforetske pokretljivosti (EMSA). Navedene in vitro analize vršene su kako u normalnim, tako i u uslovima eritroidnog stresa, koji je u ćelijskoj kulturi izazivan dodavanjem eritropoetina.U cilju identifikacije potencijalnih sekundarnih modifikatora p-talasemijskih sindroma sekvenciranjem je analiziran gen KLF1 čovjeka, a otkrivene genetičke varijante su testirane kao mogući uzročnici povišenog nivoa HbF u adultnom dobu. Izučavan je i uticaj detektovanih varijanti na ekspresiju KLF1 i BCL11A gena metodom Real-time PCR.Rezultati naše studije ukazali su na Hb Lepore-BW kao najčešćeg uzročnika talasemija u Srbiji, sa učestalošću od 26.2%, dok zajednička učestalost genetičkih varijanti IVS-I1-745, p°39 i IVS-l-110 u srpskoj populaciji premašuje 50%. Sprovedena haplotipska analiza ukazala je na haplotip I i haplotip II kao najčešće p-globinske haplotipove u srpskoj populaciji. Ove analize ukazale su na asocijaciju haplotipa I i Hb Lepore-BW, IVS-l-1 i IVS-l-110 varijanti, odnosno haplotipa II i p°39 varijante.Funkcionalna analiza -158 (C>T) varijante u promotorskom regionu Gy-globinskog gena, pokazala je da ova varijanta nema uticaj na ekspresiju datog globinskog gena, kako ustandardnim, tako ni u uslovima eritroidnog stresa. S druge strane, funkcionalna analiza 4bp delecije promotorskog regiona Ay-globinskog gena, ukazala je na prisustvo potencijalnog regulatornog elementa na ovoj poziciji u uslovima eritroidnog stresa.U našoj studiji su kod osoba sa povišenim nivoom HbF otkrivene dvije nove, dosad neprijavljene varijante u KLF1 genu, -148 (G>A) u promotorskom regionu i p.F182L u drugom egzonu KLF1 gena, kao i poznata varijanta, p.S102P. Analiza uticaja navedenih genetičkih varijanti na ekspresiju BCL11A i KLF1 gena ukazala je na promotorsku varijantu -148 (G>A) kao potencijalnog pozitivnog regulatora ekspresije oba gena.Rezultati prezentovani u ovom radu predstavljaju korak ka razumijevanju fenotipskog diverziteta, kao i patofizioloških mehanizama koje leže u osnovi p-talasemijskih sindroma. Izučavanje varijanti u sekundarnim genima-modifikatorima [3-talasemijskih sindroma i njihovog uticaja na fenotipsku varijabilnost, može biti osnova za uvodenje genske terapije ovih monogenskih oboljenja.

Opis (srp)

-

Jezik

srpski

Datum

2011

Licenca

© All rights reserved