Naslov (srp)

Transdiferencijacija alfa ćelija pankreasa miša u ćelije koje proizvode insulin ciljanom metilacijom DNK primenom Epi-CRISPR sistema : doktorska disertacija

Autor

Đorđević, Marija B., 1990-

Doprinosi

Arambašić-Jovanović, Jelena, 1977-
Tolić, Anja, 1988-
Vidaković, Melita, 1972-
Savić-Pavićević, Dušanka, 1972-
Dinić, Svetlana, 1971-

Opis (srp)

Ekspresija gena za Arx (engl. Aristaless related homeobox) koji ima glavnu ulogu u održavanju identiteta alfa ćelija endokrinog pankreasa regulisana je metilacijom i predstavlja glavni target za ćelijsko reprogramiranje kao jedna od strategija u terapiji dijabetesa koji u osnovi ima poremećen izvor insulina usled propadanja beta ćelija.Cilj ove doktorske disertacije je podrazumevao ispitivanje sposobnosti transdiferencijacije alfa ćelija pankreasa miša u ćelije koje proizvode insulin nakon uvođenja metilacije u promotoru Arx-a. Nakon tranzijentne transfekcije αTC1-6 ćelijske linije pomoću epigenetičkog alata za ciljanu gensku represiju ispitivani su efekti uvedene metilacije na ekspresiju gena specifičnih za beta ćelije.Optimizacijom nukleofekcije αTC1-6 ćelija uspostavljeni su uslovi pomoću kojih je dostignuta efikasnost od 71,1% pri vijabilnosti ćelija od 80%. Visoka efikasnost uvođenja metilacije dCas9-Dnmt3a3L-KRAB fuzionim (EpiCRISPR) konstruktom je pokazana targetovanim bisulfitnim sekvenciranjem. Utišavanje Arx-a praćeno pokretanjem ekspresije Ins2 na 5. i 7. danu nakon transfekcije detektovano je metodom RT-qPCR-a i analizom transkriptoma. Proteinski nivo insulina detektovan je imunocitohemijskom metodom do 12. dana, a oslobađanje iz ćelija enzimskim imunoesejem na 7. danu nakon transfekcije. Pokretanje procesa transdiferencijacije αTC1-6 ćelija ispitivano je analizom prisustva markera beta ćelija.Rezultati su pokazali da jedna tranzijentna transfekcija može da inicira transdiferencijaciju ~1% alfa ćelija pankreasa u ćelije koje proizvode 35% više insulina u odnosu na lažno transfekovane (Mock) alfa ćelije. Delujući na plastičnu prirodu epigenoma, uspešno je iniciran proces direktnog reprogramiranja alfa ćelija pankreasa u ćelije koje proizvode insulin.

Opis (srp)

Biologija - Molekularna biologija / Biology- Molecular biology Datum odbrane: 05.07.2023.

Opis (eng)

Aristaless-related homeobox (Arx) gene expression level is regulated by DNA methylation, plaing an important role in the maintenance of pancreatic alpha cell identity. Diabetes is characterized by a disturbed source of insulin, representing a good candidate for cell reprogramming strategy in diabetes therapy by Arx targeting.The aim of this doctoral dissertation was to examine the transdifferentiation ability of murine pancreatic alpha cells into insulin-producing cells induced by the targeted DNA methylation in the Arx promoter. The expression of beta specific marker was analiysed in transiently transfected αTC1-6 cells with a synthetic epigenetic tool for gene repression.The optimization of αTC1-6 cells nucleofection was established conditions by which was achieved an efficiency of 71.1% with an 80% of cell viability. The high efficiency of methylation induction by the dCas9-Dnmt3a3L-KRAB fusion (EpiCRISPR) construct was confirmed by targeted bisulfite sequencing. The Arx silencing followed by induction of Ins2 expression on 5 and 7 days after transfection was detected by RT-qPCR and transcriptome analysis. The insulin protein level was detected immunocytochemicaly until the 12th post-transfection day, and released insulin was detected by the enzyme immunoassay on the 7th post-transfection day. The initiation of the transdifferentiation process of αTC1-6 cells was examined by analyzing the presence of beta cell specific markers.The results showed that a single transient transfection initiate the transdifferentiation of ~1% of alpha cells into cells that produce 35% more insulin compared to mock-transfected cells. Acting on the epigenome plastic nature, the direct reprogramming of pancreatic alpha cells into insulin-producing cells was successfully initiated.

Jezik

srpski

Datum

2023

Licenca

Ovo delo je licencirano pod uslovima licence
Creative Commons CC BY-NC-SA 3.0 AT - Creative Commons Autorstvo - Nekomercijalno - Deliti pod istim uslovima 3.0 Austria License.

http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/at/legalcode

Predmet

OSNO - Opšta sistematizacija naučnih oblasti, Molekularna biologija

Arx, CRISPR/Cas9, alfa ćelije pankreasa, dijabetes, editovanje epigenoma, ciljana metilacija DNK, transfekcija

577.2:577.175.72(043.3)

OSNO - Opšta sistematizacija naučnih oblasti, Molekularna biologija

ARX, CRISPR/dCas9, pancreatic alpha cells, diabetes, epigenetic editing, targeted DNA methylation, transfection