Naslov (srp)

Analiza ekspresije gena koji obezbeđuje rezistenciju bakterije Escherichia coli K12 na antibiotik novobiocin

Autor

Jovanović, Milija Z., 1965-

Doprinosi

Topisirović, Ljubiša
Jovanović, Goran
Simić, Draga
Knežević, Jelena

Opis (eng)

CysB is a tetrameric LysR-type transcription factor that acts as an activator of the cysregulon, cbl and adi genes, tau and ssu operons, etc., while cysB gene itself is under negativeautoregulation. Previously, cysB auksotrophic mutants to cystein and mutants with increasedresistance to novobiocin had been isolated by screening the azaserine and novobiocinresistant colonies. hslJ gene whose expression is negatively regulated by CysB was identifiedby generating random chromosomal lacZ gene fusions using the λplacZMu system. In thisstudy, the operon fusions hslJ-lacZ were constructed by clonong different DNA fragments ofthe region upstream of the hs/J gene. Ву using these fusions placed on plasmids, the minimalpromoter/regulatory region was defined. The hslJ transcription start site was determined andthe inspection of DNA sequence revealed one putative σ70 promoter. WT CysB and CysBI33N fusion proteins, shown to be active in vivo, were purified on affinity chromatographycolumns and employed in /п vitro studies. These fusion proteins were able to interact withpotential to form tetramers, hexsamers, and higher order structure oligomers. Both, CysB andits DNA-binding mutant CysB I33N bind hslJminimal regulatory region and ligand, NAS,increases the efficiency of this binding. Taking together the activities of hslJ-lacZchromosomal/low сору plasmids placed operon fusions introduced to either cysB+ or cysB-strains, and /п vitro studies of CysB binding in hsIJ locus, it is very likely that CysB is aclassical repressor of hslJtranscription. Analysis of different cysB mutants used in this studyshowed that interallelic complementation exists, and some cysB mutation can be reversed tofunctionality by the cysB allele mutated in different region. These results revealed that DNAbindingmutant CysB I33N otherwise inactive in regulating the cys regulon, binds hslJminimal regulatory region and represses the transcription. Also, CysB S277Ter protein thatcarries the truncation of the C-terminal region, can not oligomerize, efficiently interact withDNA, and repress the hslJ transcription. The expression of hslJ is tightly controlled and verylow. High number of intracellular hslJ gene copies is lethal but when present in low numberof copies, the increased novobiocin resistance as a direct consequence exists. This is in directcorrelation with the level of hslJ transcription and repression imposed by the CysB. WhenCysB is inactive the hslJ transcription is more effective and the resistance to novobiocin iselevated. Considering the deduced amino acid sequence and the computer analyses, thelocalization of the HslJ protein is predicted to be in the outer membrane of the cell. Thisassumption is supported by the fact that hslJ::ΩKan mutation activates the operon fusionpspA-lacZ shown to be sensitive to changes provoked by inappropriate outer membraneproteins localization.

Opis (srp)

CysB protein je transkripcioni regulator koji deluje kao tetramer i pripada LysR familiji. On je aktivator gena cisteinskog regulona, cbl gena, tauABCD operona, ssuEADCB operona, adi gena i dr. Negativno reguliše ekspresiju sopstvenog cysB gena. U prethodnom radu selekcijom na azaserinu i novobiocinu su izolovani cysB mutanti koji su bili auksotrofi za cistein i pokazivali povećanu rezistenciju na antibiotik novobiocin. Primenom sistema λpJacZMu fuzija identifikovan je gen hslJ koji je negativno regulisan CysB proteinom I uključen u mehanizam rezistencije bakterije E. coli na novobiocin. U ovom radu su konstruisane operonske fuzije hs1J-lacZ koje nose različite dužine regulatomog regiona hslJ gena. Merenjem aktivnosti ovih fuzija determinisan je minimalni promotorski i regulatorni region. Određen je start transkripcije hslJ gena i definisan putativni σ70 promotor. CysB protein i mutirani CysB I33N izolovani su i prečišćeni na afinitetnoj Ni-NTA rezin koloni. Pokazano je da oba proteina imaju potencijal za oligomerizaciju stvarajući monomere, tetramere, heksamere i oligomere višeg reda. CysB protein i mutant CysB I33N vezuju se za minimalni regulatomi region hslJ gena a NAS povećava efikasnost vezivanja. Rezultati aktivnosti operonskih fuzija hslJ-lacZ u cysB+ i cysB- sojevima kao i in vitro analize vezivanja CysB proteina za hslJ lokus govore u prilog tome da je CysB protein represor hslJ transkripcije. Analiza mutacija u različitim cysB mutanatima pokazala je da oni sadrže defektan CysB protein koji može komplementacijom sa dmgim mutiranim CysB proteinom ostvariti funkcionalnu aktivnost što je praćeno rastom na minimalnoj podiozi bez cisteina I smanjenjem nivoa rezistencije na novobiocin. Ova interalelska komplementacija CysB mutanata pokazala je da se DNK vezujući mutant, CysB I33N, inače neaktivan u regulaciji cys regulona, aktivno vezuje za hslJ lokus i reprimira hslJ transkripciju kao i da je Cterminalni region CysB proteina odgovoran za oligomerizaciju i efikasno vezivanje CysB proteina u regulatornom regionu hslJ gena. Nizak nivo ekspresije hslJ gena strogo je kontrolisan; prisustvo hslJ na plazmidu sa većim brojem kopija letalno je za ćeliju. Ukoliko je hslJ gen prisutan na plazmidu sa malim brojem kopija dolazi do efekta genske doze I povećanja rezistencije na antibiotik novobiocin. Ovo je u direktnoj korelaciji sa povećanim nivoom transkripcije hslJ gena kada je represor CysB inaktivan ili slabo aktivan, što dovodi do povećanja rezistencije na novobiocin. Prema podacima kompjuterske analize, hslJ protein je najverovatnije lokalizovan u spoljašnjoj membrani ćelije. U prilog ovome idu i rezultati dobijeni merenjem aktivnosti operonske fuzije pspA-lacZ čija se aktivnost povećava oko pet puta ukoliko je u ćeliji na plazmidu umesto WT hslJ prisutan mutirani gen hslJ::ΩKan čiji izmenjeni produkt bi svojom nepravilnom lokalizacijom u membrani narušio njen integritet o aktivirao psp operon.

Opis (srp)

-

Jezik

srpski

Datum

2002

Licenca

© All rights reserved